张锋团队开发出第三个基因剪刀CRISPR-Cas12b 可减少

作者: 生命科学  发布:2019-11-06
张锋团队成功开发“新款”基因剪刀

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科技日报北京1月22日电 据英国《自然·通讯》杂志22日发表的一篇论文,美国麻省理工学院—哈佛大学博德研究所张锋团队报告了第三个可以编辑人类细胞基因组的CRISPR-Cas系统。实验中,CRISPR-Cas12b系统比众所周知的Cas9,表现出了对靶序列更高的特异性。

在CRISPR系列的基因编辑系统中,Cas9酶是一个非常关键的组成部分,但是CRISPR/Cas9的脱靶效应是一直急需攻克的难题,它严重制约了基因编辑系统的实际临床应用的可能。因为脱靶效应,使得基因编辑的特异性可能不高,会产生异想不到的“副作用”,脱靶效应严重制约了CRISPR/Cas9基因编辑技术的广泛应用。攻克脱靶效应,是科研人员一直追求的梦想。1月23日,CRISPR-Cas基因编辑系统的先驱之一张锋教授在《自然》子刊《Nature Communications》发布一项重要进展,报告了第三个可以编辑人类细胞基因组的CRISPR-Cas系统:CRISPR-Cas12b。

CRISPR基因编辑技术被称为生命科学领域的“游戏规则改变者”,这一突破性技术通过一种名叫Cas9的特殊编程的酶来发现、切除并取代DNA的特定部分,因此CRISPR-Cas9是一个多功能基因组编辑系统。

多功能基因组编辑系统CRISPR-Cas的问世,掀起了一场生物技术革,CRISPR基因编辑技术被称为生命科学领域的“游戏规则改变者”。在科学研究和医疗研发方面,这套基因编辑工具得到广泛应用,以此为基础的基因编辑疗法也展开临床试验,在治疗人类遗传病方面初现潜力。

但Cas9却并非Cas蛋白家族中唯一一种RNA导向的核酸酶(即一种能切割DNA的酶)。除了Cas9之外,研究人员还发现了Cas12a和Cas12b。Cas12a已被开发成基因组编辑工具,而Cas12b尚未被完全开发,这其中至少有一部分原因是由于它嗜高温的特性。

这一系统中的“元老”成员就是我们已经熟悉的Cas9。不过Cas9也并非没有限制,比如切割非靶点序列的脱靶效应就是一个问题。鉴于CRSPR-Cas系统在微生物中广泛存在,科学家们将Cas蛋白的类型范围不断扩大,寻找新秀,例如Cas12a。

张锋及其同事对Cas12b进行了研究,因为这种蛋白比Cas9或Cas12a更小,更容易通过病毒载体实现细胞间递送。但原始结构的Cas12b会切割双链DNA中的非靶标单链。为了解决这一问题,研究团队对Cas12b重新进行了设计,增强其在人体体温下的活性。与Cas9相比,重新设计的Cas12b在细胞培养实验中对靶序列具有更高的特异性。

▲2017年1月,张锋教授与NIH两位科学家在《Cell》发文,详细归纳了2类CRISPR系统的特点和作用机制

研究人员表示,想要将Cas12b改造成和Cas9一样应用广泛的工具,目前还有很多工作要做,但第三个潜在基因组编辑系统的出现,将会给全世界研究人员提供更多选择。

在与Cas9、Cas12a同属2类CRISPR系统的Cas蛋白中,还有一个富有潜力的成员,就是Cas12b。Cas12b蛋白比Cas9和Cas12a更小,因此更容易通过病毒载体实现细胞间递送。

此前,CRISPR因其巨大的商业价值引发了专利大战。美国专利商标局专利审判和上诉委员会2017年2月作出关键裁决之后,加州大学伯克利分校提起上诉,2018年9月联邦巡回上诉法院维持判决,张锋所在机构继续占据上风。

虽然有这样的优势,Cas12b的却遇到了一个阻碍。性能最佳的Cas12b来自一种嗜酸耐热菌,但它作为DNA裂解酶的最佳活性需要高达48℃。也就是说,如果放进哺乳动物细胞内,达不到这种Cas12b的温度要求,酶活性就不能发挥。怎么“解锁”这种Cas蛋白呢?

相关论文信息:https://doi.org/10.1038/s41467-018-08224-4

▲Cas9、Cas12a、Cas12b三种核酸酶的基因序列模式图和蛋白质结构示意图

为了适用于人类基因组编辑,张锋教授和同事们首先在Cas12b蛋白家族中寻找喜欢常温的成员。最终,根据同源序列比对,他们从一种叫作外村尚芽孢杆菌的细菌中鉴定出了在人体体温能保持核酸酶活性的BhCas12b。并且,研究人员还通过调整指导RNA的结构,让Cas12b的效率得到大幅提升。

可是,新的问题来了。体外切割实验发现,原始结构的Cas12b在DNA双链断裂时会切割非靶标单链,并且温度越低,这种错误发生得越多。为了解决这个问题,研究者对Cas12b进行了工程改造。根据蛋白质晶体结构的线索,研究人员通过4个点突变,得到了重新设计的新Cas12b,让酶的活性位点更容易和DNA靶序列接近。

经过重新设计的Cas12b,基因组编辑的潜能如何呢?在细胞培养实验中,研究人员针对多个基因的多个靶序列考察了Cas12b的编辑效率。对随机引入插入缺失的分析结果显示,新的Cas12b的编辑效率与Cas9和Cas12a相当、甚至更高,足以在人体细胞中作为可编程的基因组编辑工具。

除了有效性,特异性对于一款强大的基因组编辑工具来说也非常重要。这一点,研究团队也在人类细胞中利用GUIDE-seq技术对全基因组范围内的脱靶效应进行了检测。结果表明,相比常用的Cas9,Cas12b导致的错误插入缺失都要少得多,脱靶性显著降低。

▲GUIDE-seq分析显示,重新设计的Cas12b没有出现Cas9那样的脱靶效应

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